Control negativo: células sin marcar o células marcadas con el isotipo control. (En caso de GFP células parentales)

Controles de compensación si es necesario: Si la tinción es con varios fluorocromos serán necesarios los monomarcajes de cada fluorocromo.

El marcador de muerte celular será añadido por el servicio de citometría y su elección dependerá de la combinación de fluorocromos que haya en la muestra.

Los controles solo necesitan un volumen final de 500µl con 500.000 células. Se pueden traer en tubos de FACS en FACS Buffer o Sorting Buffer.

Traer las células a 4ºC y protegidas de la luz.

Muestras en tubos estériles en hielo.

Filtrarlas siempre mediante cellstrainer.

La concentración será de 30x10⁶ células/ml. Cuando las células sean mayores de 20 micras la concentración será de unos 10x10⁶ células/ml.

En tubos de cultivo de 15ml pon 1ml de medio de cultivo conteniendo  suero al 20% o FBS estéril. Puedes calcular el volumen aproximado de células que vas a recoger y utilizar tubos más pequeños (tubos de FACS, eppendorf…), si lo deseas consulta con el servicio de citometría.

Tubos de citómetro: Ref. 352052  BD Falcon

Tubo de 15ml polipropileno: Ref 430791 Corning o similar.

Cell strainer 50 micras (50 u): Ref. 352350 BD Falcon

EDTA 0.5M pH8.0 (4X100ml): Ref. 15575-020 GIBCO

Tubo de citómetro con cell-strainer cap: Ref. 352235 BD Falcon

1x PBS (sin Ca/Mg++)-1mM EDTA-25mM HEPES pH 7-0.5% Fetal Bovine Serum (Inactivado por calor)+ 1% antibióticos (penicilina y estreptomicina)

Conservar a 4ºC

Si las células son adherentes se debe aumentar la concentración de EDTA a 5 mM.

Si hay un gran número de células muertas se recomienda agregar 10U/mL DNAasa II.