Requerimientos para cualquier separación celular
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Controles
Control negativo: células sin marcar o células marcadas con el isotipo control. (En caso de GFP células parentales)
Controles de compensación si es necesario: Si la tinción es con varios fluorocromos serán necesarios los monomarcajes de cada fluorocromo.
El marcador de muerte celular será añadido por el servicio de citometría y su elección dependerá de la combinación de fluorocromos que haya en la muestra.
Los controles solo necesitan un volumen final de 500µl con 500.000 células. Se pueden traer en tubos de FACS en FACS Buffer o Sorting Buffer.
Traer las células a 4ºC y protegidas de la luz.
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Muestras para separar
Muestras en tubos estériles en hielo.
Filtrarlas siempre mediante cellstrainer.
La concentración será de 30x106 células/ml. Cuando las células sean mayores de 20 micras la concentración será de unos 10x106 células/ml.
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Tubos de recolección
En tubos de cultivo de 15ml pon 1ml de medio de cultivo conteniendo suero al 20% o FBS estéril. Puedes calcular el volumen aproximado de células que vas a recoger y utilizar tubos más pequeños (tubos de FACS, eppendorf…), si lo deseas consulta con el servicio de citometría.
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Material
Tubos de citómetro: Ref. 352052 BD Falcon
Tubo de 15ml polipropileno: Ref 430791 Corning o similar.
Cell strainer 50 micras (50 u): Ref. 352350 BD Falcon
EDTA 0.5M pH8.0 (4X100ml): Ref. 15575-020 GIBCO
Tubo de citómetro con cell-strainer cap: Ref. 352235 BD Falcon
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Sorting Buffer Básico
1x PBS (sin Ca/Mg++)-1mM EDTA-25mM HEPES pH 7-0.5% Fetal Bovine Serum (Inactivado por calor)+ 1% antibióticos (penicilina y estreptomicina)
50 mL
1x PBS (Ca/Mg++ free)
Hasta 50 mL
2.5mM EDTA (stock 500mM)
250 uL
25mM HEPES pH 7.0 (stock 1M)
1.25
0.5% FBS (Inactivado)
250 uL
1% antibióticos (pen and strep)
500 uL
Conservar a 4ºC
Si las células son adherentes se debe aumentar la concentración de EDTA a 5 mM.
Si hay un gran número de células muertas se recomienda agregar 10U/mL DNAasa II.
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Concentración óptima de las células
Tamaño del orificio del nozzle
Tipo celular
Concentración final (por mL)*
70um
Linfocitos, timocitos
8-15 x 106
80um
Células activadas, líneas celulares pequeñas
7-10 x 106
100um
Células adherentes, células grandes
5-9 x 106
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Goretti Azparren
Secretaria Citometría de flujo |